细菌的分离与鉴别

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细菌分离是指从临床发病动物组织脏器、粪便或者混杂微生物中获得单一菌株的培养方法。通过分离，使细菌在平板中分散生长，便于观察单个菌落特性，也易挑取单个菌落，进行生化鉴定，确定细菌种类。

一、实验前准备

1、实验物品准备

手术剪刀、酒精灯、接种环、镊子、灭菌平皿、手术盘、灭菌的棉签、酒精棉球、自封袋、记号笔等。普通恒温培养箱、无菌室和超净工作台。

2、培养基准备

根据所分离的细菌种类不同，选择不同种类的鉴别培养基，如大肠杆菌（麦康凯琼脂培养基或伊红美蓝琼脂培养基）、葡萄球菌（高盐甘露醇琼脂培养基或Baird-Parker培养基）、霉菌（马铃薯葡萄糖培养基或孟加拉红培养基）、沙门氏菌（SS琼脂培养基或HE培养基）、弧菌（氯化钠蔗糖琼脂培养基或TCBS琼脂培养基）、弯曲杆菌（改良Camp-BAP琼脂培养基或skirrow琼脂培养基）、鼻气管鸟疫杆菌（含有庆大霉素或多粘菌素的5%绵羊血液的琼脂平板）。

根据要分离的细菌选择培养基后，严格按照使用说明书用蒸馏水进行配置。注意在配置时一定要混合均匀后放入微波炉或使用万用电炉加热至沸腾。使用封口膜或棉塞进行封口（防菌），外层用报纸进行包装（防水），放入高压锅中进行灭菌。

将灭菌后的培养基和培养皿放入超净台中,待培养基不烫手时（60℃左右）将其倒入培养皿(提前标记好制作日期和培养基名称)中，厚度为3-4mm。配置三糖铁时，直接倒入灭菌试管中，以5ml为宜，倾斜放置，做成斜面。晾干、待其凝固后放入37℃恒温箱中倒置烘20小时。取出培养皿,自封袋封好放冰箱4℃保存,待检测时用(注：不要放太长时间，以免水分流失太多)。

3、病料的采集与保存

将送检的病鸡、新鲜死鸡直接打开腹腔，以无菌操作的方法，采取有明显病变部位的组织，直接放到灭菌的培养皿中（或一次性自封袋中），如病死鸡的肝、脾、心包、气囊膜、眼球液、腹水、关节渗出液及脓液、输卵管内容物等病料，立即进行细菌分离培养，如不能及时进行实验需将病料放到0-4℃保存待检，不得超过24小时。若24小时内未能进行实验，需将病料置-20℃保存。

4、接种方法

平板划线接种法

本法是最常用的分离培养细菌的方法，其目的是将混有多种细菌的临床组织或混杂菌液，经划线分离使单个分散生长形成单个菌落。

A、分区画线法：适用于含菌量较多的样品。

a、用接种环先将标本涂布在平板的第一区并作数次划线，再在二、三区……依次用接种环划线。

b、每划一个区域，应将接种环烧灼一次，待冷却后再划下一区域。划每一区域时应接触上一区域的接种线2-3次，使菌量逐渐减少，以形成单个菌落。

c、划线完毕，将平板加盖，倒置，以适宜的培养条件培养。

B、连续画线法：适用于含菌量相对较少的样品。

先用接种环将病料或混杂菌液均匀涂布于平板培养基表面一角，然后用接种环自标本涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平行线。

液体培养基接种法

用棉签或接种环挑取病料或菌液，在试管壁和液面交界处轻轻摩擦，使菌混匀在液体培养基中。

倾注平板法

本法主要用于液体样品或稀释后的固体样品的细菌总数检测，如水中微生物数量检测等。

吸取用灭菌生理盐水适量稀释（通常做10-1-10-4稀释）的样品稀释液1ml，置灭菌平皿内，倾倒以灭菌溶化并冷却至50℃左右的培养基15-20ml，混匀，待其冷却后，倒置。于37℃恒温培养箱中培养后，计数培养基内菌落数，乘以稀释倍数，即可算出每毫升被检物的细菌数。

穿刺培养法

此法用于保存菌种，观察某些生化反应。以接种针挑取细菌培养物，插入固体培养基的中央穿刺至培养基2/3处，然后沿原穿刺线退回接种针。于37℃恒温培养箱中培养后观察反应情况。

5、染色方法

制片

a、涂片

取保存在酒精中的干净玻片，在酒精灯上烧去残留酒精，待凉，用记号笔在玻片的右侧，注明菌名、染色类型。用接种环在玻片中央滴加一小滴无菌生理盐水，以无菌操作取单个菌落，在玻片上均匀涂抹；或无菌操作法用接种环取菌液1-2环，均匀涂布载玻片中央。（注意菌落涂片以肉眼无明显可见菌块为宜，菌液尽量涂开）。

b、干燥

涂片放在室温下自然干燥，也可将标本放在酒精灯火焰上方约10-15cm处烘干，以助水分蒸发。

c、固定

将已干燥的涂片向上，在酒精灯外焰处迅速通过2-3次，以不烫手背为宜，使得菌体与玻片牢固结合。

革兰氏染色

a、初染

在已干燥固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液（以覆盖整个菌层为度），1min后，水洗，甩干。

b、媒染

滴加革兰碘液于抹片上，1min，水洗，甩干。

c、脱色

滴加95%乙醇脱色并轻轻晃动载玻片，直至洗出的乙醇不出现紫色时停止（约0.5min），水洗，甩干，滤纸吸干残存水滴。

d、复染

滴加沙黄复染液或石炭酸复红溶液，1min，水洗，滤纸吸干后，备镜检。

e、结果

革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

二、操作方法

1、无菌环境

打开超净台紫外灯开关，紫外灭菌30分钟，关闭紫外灯，再打开风机10分钟。再将待检病料、培养基等物品放入超净台内。

2、病料处理

对疑似感染细菌的病变组织器官，应先用刀片灼烧组织或渗出物，烫灼组织表面杂菌，在烧灼部位打开1cm左右的切口，然后再用接种环或消毒棉签通过灼烧过的表面插入组织内取样，取样后进行划线接种。

3、接种培养

根据样品中细菌的多少选择平板划线方法，接种后，将平板倒置放入37℃恒温培养箱中培养8-12小时。

4、结果观察

12小时后观察菌落形态，初步判断可能的疑似菌。再用接种环挑取单个菌落进行染色镜检观察。

沙门氏菌鉴别培养基

细菌培养

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